کروماتوگرافی لایه نازک چیست؟

کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography یا TLC) یکی از تکنیک‌های جداسازی ساده، سریع و کم‌هزینه در شیمی تجزیه است که از دهه ۱۹۳۰ میلادی مورد استفاده قرار گرفته و همچنان در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و صنعتی کاربرد گسترده‌ای دارد. این روش بر پایه تفاوت در ضریب توزیع (Partition Coefficient) ترکیبات بین فاز ساکن و فاز متحرک عمل می‌کند و امکان شناسایی، خالص‌سازی و آنالیز نیمه‌کمی مواد را فراهم می‌آورد. در این مقاله، با استناد به منابع علمی معتبر، به بررسی اصول، روش اجرا، کاربردها، محدودیت‌ها و پیشرفت‌های اخیر TLC می‌پردازیم.

اصول تئوری روش کروماتوگرافی لایه نازک

در کروماتوگرافی لایه نازک، ابتدا نمونه‌ای از مخلوط مورد نظر روی صفحه‌ای مخصوص قرار داده می‌شود. این صفحه دارای فاز ساکن است که معمولاً لایه‌ای نازک از موادی مانند سیلیکاژل، آلومینا یا سلولز است و روی زیرلایه‌ای از شیشه، آلومینیوم یا پلاستیک پوشیده می‌شود.

سپس فاز متحرک که معمولاً یک حلال یا ترکیبی از چند حلال است، از پایین صفحه به‌سمت بالا حرکت می‌کند. این حرکت به‌دلیل خاصیت مویینگی (Capillary Action) اتفاق می‌افتد و باعث می‌شود اجزای مختلف مخلوط با سرعت‌های متفاوت روی صفحه جابه‌جا شوند.

هر جزء از مخلوط بسته به تمایلش به فاز ساکن یا فاز متحرک رفتار متفاوتی دارد:

• اگر تمایل بیشتری به فاز متحرک داشته باشد، سریع‌تر حرکت می‌کند.
• اگر جذب فاز ساکن شود، کندتر بالا می‌رود و در پایین‌تر متوقف می‌شود.

به این ترتیب، اجزای مخلوط از هم جدا می‌شوند و لکه‌هایی در نقاط مختلف صفحه ایجاد می‌گردد.

برای مقایسه موقعیت این لکه‌ها، از عددی به‌نام ضریب نگهداری (Rf) استفاده می‌شود که طبق رابطه زیر محاسبه می‌گردد:

عدد Rf همیشه بین ۰ تا ۱ است و فقط زمانی قابل مقایسه است که شرایط آزمایش مثل نوع فاز ساکن و حلال یکسان باشد.

با توجه به نوع مواد و فازها، این روش ممکن است به‌صورت کروماتوگرافی جذب (Adsorption) یا کروماتوگرافی تفکیک (Partition) یا ترکیبی از هر دو انجام شود.

 اجزای اصلی دستگاه کروماتوگرافی لایه نازک

صفحه TLC (فاز ساکن):
معمولاً از شیشه، آلومینیوم یا پلاستیک ساخته می‌شود که روی آن لایه‌ای نازک از سیلیکاژل (SiO₂)، آلومینا (Al₂O₃) یا سلولز پوشیده شده است. این لایه نقش فاز ساکن را دارد و ترکیبات مختلف را با قدرت‌های متفاوتی جذب می‌کند.

فاز متحرک (حلال یا ترکیب حلال‌ها):
حلال انتخابی باید بتواند اجزای نمونه را به اندازه کافی حل کند و در عین حال جداسازی را به‌خوبی انجام دهد. انتخاب فاز متحرک یکی از مهم‌ترین مراحل طراحی TLC است.

نمونه (Sample):
نمونه به صورت محلولی غلیظ آماده و با کمک میکروپیپت یا مویینه در نقطه‌ای کوچک در پایین صفحه قرار داده می‌شود.

محفظه توسعه (Development Chamber):
ظرفی بسته است که حاوی حلال است. صفحه TLC داخل آن قرار می‌گیرد تا حلال از پایین به بالا حرکت کند.

وسیله آشکارسازی (Visualization):
چون بسیاری از مواد بی‌رنگ هستند، برای دیدن لکه‌ها از نور فرابنفش (UV) یا اسپری معرف‌های شیمیایی مانند ید یا نیترات نقره استفاده می‌شود.

روش کاری (پروتکل) کروماتوگرافی لایه نازک

در کروماتوگرافی لایه نازک، فرآیند به‌صورت گام‌به‌گام و با دقت بالا انجام می‌شود تا جداسازی مؤثر اجزای نمونه حاصل گردد:

• در ابتدا، صفحه‌ی TLC آماده می‌شود. این صفحه ممکن است از پیش آماده باشد یا از ورقه‌های بزرگ‌تر بریده شود. در صورت نیاز، برای حذف رطوبت، صفحه پیش از استفاده در دمای حدود ۱۱۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ دقیقه گرم می‌شود تا فعال گردد.
• سپس در فاصله‌ی تقریبی یک سانتی‌متر از لبه‌ی پایین صفحه، خط اولیه (Baseline) با مداد رسم می‌شود. این خط نقطه‌ی شروع نمونه‌ها را مشخص می‌کند. در ادامه، نمونه‌ها به صورت نقطه یا نوار باریک بر روی این خط قرار داده می‌شوند. حجم نمونه معمولاً بسیار کم و در حد چند میکرولیتر است تا از پخش شدن زیاد لکه و کاهش دقت جداسازی جلوگیری شود.
• در گام بعد، محفظه توسعه (Development Chamber) آماده می‌شود. در ته این محفظه مقدار مناسبی از فاز متحرک (حلال یا ترکیب حلال‌ها) ریخته می‌شود، به‌طوری که سطح آن پایین‌تر از خط اولیه صفحه باشد. گاهی برای ایجاد تعادل بخار حلال، یک نوار کاغذ فیلتر آغشته به حلال در داخل محفظه قرار داده می‌شود تا بخارات حلال به طور یکنواخت در فضا پخش شود.
• سپس صفحه‌ی آماده‌شده به حالت عمودی درون محفظه قرار می‌گیرد به‌گونه‌ای که نقطه‌ی نمونه در تماس مستقیم با فاز متحرک نباشد. با بسته شدن درِ محفظه، شرایطی ثابت و اشباع از بخار حلال ایجاد می‌شود. در این مرحله، حلال به‌تدریج و به‌واسطه‌ی خاصیت مویینگی در طول صفحه به سمت بالا حرکت می‌کند و اجزای مختلف نمونه را با خود جابه‌جا می‌نماید.
• زمان لازم برای توسعه‌ی صفحه بسته به نوع حلال، ضخامت لایه‌ی جاذب، دما و ماهیت ترکیبات نمونه متفاوت است. زمانی‌که جبهه‌ی حلال (Solvent Front) به ارتفاع مورد نظر یا نزدیک به بالای صفحه می‌رسد، صفحه از محفظه خارج شده و بلافاصله محل توقف حلال با مداد علامت‌گذاری می‌شود.
• در ادامه، صفحه خشک شده و لکه‌های به‌وجودآمده توسط روش‌های آشکارسازی مختلف قابل مشاهده می‌شوند. برای بسیاری از مواد آلی، از نور فرابنفش (UV) استفاده می‌شود، اما در مواردی که ترکیبات بی‌رنگ هستند، از اسپری معرف‌های شیمیایی مانند ید یا نیترات نقره بهره گرفته می‌شود.

تصاویر صفحات TLC پس از توسعه: (a) در نور مرئی، (b) در تابش فرابنفش (UV)، (c) توزیع شدت فلورسانس.

• پس از مشاهده‌ی لکه‌ها، فاصله‌ی حرکت هر لکه از خط اولیه تا مرکز آن و نیز فاصله‌ی حرکت جبهه‌ی حلال اندازه‌گیری می‌شود. از تقسیم این دو مقدار، ضریب نگهداری (Rf) به‌دست می‌آید که عددی بین ۰ تا ۱ بوده و برای شناسایی یا مقایسه‌ی ترکیبات با مواد مرجع مورد استفاده قرار می‌گیرد.
• در نهایت، بر اساس موقعیت لکه‌ها، رنگ آن‌ها و مقدار Rf، می‌توان نوع ترکیبات موجود در نمونه را تعیین کرد، خلوص مواد را بررسی نمود یا میزان پیشرفت واکنش‌های شیمیایی را ارزیابی کرد.

مزایا و محدودیت‌های کروماتوگرافی لایه نازک

مزایا:

• هزینه کم و تجهیزات ساده نسبت به بسیاری از روش‌های کروماتوگرافی دیگر.
• زمان اجرای کوتاه و امکان انجام هم‌زمان چندین نمونه.
• نیاز به مقدار نمونه کم (میکروگرم)
• انعطاف‌پذیری در انتخاب فاز ثابت، موبایل و روش آشکارسازی.

محدودیت‌ها:

• جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ممکن است دشوار باشد (رزولوشن پایین‌تر نسبت به کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC)).
• برای تعیین کمی (Quantitative) دقیق، چندان مناسب نیست مگر با اصلاحات ویژه.
• شرایط (نوع صفحه، حلال، دما، رطوبت) می‌توانند تاثیر زیادی بر نتیجه بگذارند، لذا تکرارپذیری ممکن است کمتر از روش‌های خودکار باشد.

کاربردهای مهم کروماتوگرافی لایه نازک

• ارزیابی خلوص و شناسایی ترکیب‌ها: در آزمایشگاه‌های سنتز ارگانیک برای بررسی اینکه آیا واکنش کامل شده یا خیر.
• کنترل کیفیت در صنعت داروسازی، مواد غذایی، آرایشی: به‌عنوان مثال، در جداسازی ترکیبات گیاهی، شناسایی رنگ‌ها، آلاینده‌های محیطی.
• آنالیز اولیه قبل از روش‌های پیچیده‌تر: گاهی به‌عنوان روش پیش‌غربالگر قبل از High‑Performance Liquid Chromatography (HPLC) یا سایر روش‌ها استفاده می‌شود.
• مطالعات گیاه‌شناسی، فارماکولوژی، سم‌شناسی: مثلاً در بررسی ترکیبات فعال گیاهان دارویی یا مواد مخدر.

پیشنهادات برای آزمایش کروماتوگرافی لایه نازک بهتر

• حتماً صفحه را با مداد (نه خودکار) علامت بزنید، زیرا جوهر ممکن است حرکت کند یا ناخالصی ایجاد کند.
• حجم نمونه زیاد اعمال نکنید؛ نقطه بزرگ منجر به پخش و جداسازی ضعیف می‌شود.
• قبل از اجرا، حلال مناسب را انتخاب و در صورت لزوم چند نسبت امتحان کنید تا جداسازی مطلوب حاصل شود.
• در محفظه، یک قطعه کاغذ فیلتر مرطوب قرار دهید تا محیط اشباع بخار حلال شود و جریان یکنواخت گردد.
• پس از اجرای آزمایش، صفحه را سریعاً علامت بزنید، خشک کنید و در شرایط مناسب نگهداری کنید تا نقاط پخش نشوند.
• همواره یک استاندارد با ترکیب شناخته‌شده اجرا کنید تا مقایسه‌پذیری بهتری داشته باشید.
• برای مشاهده ترکیبات بی‌رنگ، از منابع UV یا معرف‌های شیمیایی استفاده کنید.

نتیجه‌گیری

روش کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) علی‌رغم سادگی، یکی از ابزارهای پایه و بسیار کاربردی در جداسازی و تحلیل ترکیبات است. با انتخاب مناسب فاز ثابت و متحرک، و رعایت نکات عملی، می‌تواند نتایج سریع، اقتصادی و قابل قبولی ارائه دهد. با این حال، برای کاربردهای با دقت بالا یا جزئیات جداسازی پیشرفته، ممکن است نیاز به روش‌های پیچیده‌تر باشد.